Isolamento de microrganismos

Um dos maiores problemas na Fitopatologia diz respeito a identificação correta do agente causal da doença.

Nesse sentido, deve-se ter todo cuidado nos procedimentos de isolamento de fitopatógenos e preferencialmene aplicar todas as etapas do postulado de Kock.

Cultura mista;

Cultura pura

Técnicas de isolamento requerem muita atenção de fitopatologistas, pois vários fatores podem interferir no processo, desviando do objetivo maior que é se chegar a uma cultura pura. As técnicas de isolamento dependem do:
Tipo de material
Meio de cultura
Inóculo

Isolamento de fungos

Método depende:
Comportamento na planta (parte aérea, folhas e frutos).
Comportamento no solo* (podridões do colo ou raízes, sistema vascular).
muitos sobrevivem como saprófitas ou na forma de estruturas de resistência: clamidósporos, esclerócios, esporos, etc

É importante conhecer a ecologia das espécies fitopatogênicas

Fatores importantes no isolamento do fungo:
Condição do material depende:
Tipo de desinfetante utilizado;
Substrato;
pH;
Condições de incubação

Material a ser isolado deve exibir sintomas típicos

Isolamento: feito na região de transição
Utilizar amostras novas e bem acondicionadas;
Desinfecção superficial de orgãos vegetais
Desinfectar superficialmente;
Lavagem com água e sabão;
Utilizar hipoclorito de sódio 1:1000;
Tecidos tenros: tempo de exposição menor;
Tecidos mais secos: imersão em água seguida de imersão no desinfetante.

Substrato utilizado
Meios BDA ou ágar-água
Fungos que crescem devagar acrescentar antibiótico ao meio;
pH do substrato
Fungos crescem bem pH 4,5 – 6,5.
Condições de incubação
Temperatura 20 a 25 graus C

Caracterização, isolamento e identificação de microrganismos

Conhecer qual microrganismo está presente é a primeira etapa na análise microbiológica.

Na natureza encontramos várias espécies de microrganismos convivendo no mesmo ambiente;

Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos em uma amostra, para então classificá-los e caracterizá-los.

Caracterização

As técnicas laboratoriais para caracterizar os microrganismos variam desde uma microscopia relativamente simples à análise de material genético encontrado na célula.

Principais informações para caracterizar espécies diferentes

Características culturais ;

Natureza do meio de cultura;

Estudo morfológico da colônia em meio sólido

Características Metabólicas

maneira pela qual o microrganismo desenvolve os processos vitais.

testes laboratoriais
metabolismo oxidativo,
metabolismo fermentativo,
catabolismo protéico

O registro das reações realizadas por uma espécie microbiana é útil e muitas vezes essencial para sua identificação.

Características Fisiológicas

atmosfera gasosa;
temperatura;
pH;
Luminosidade;
Fatores de crescimento;

Características Antigênicas –

Antígeno: substância que estimula a produção de anticorpos quando injetado em um animal.
E os anticorpos produzidos em animais de laboratórios podem ser usados para detectar a presença de antígenos únicos em culturas bacterianas e são usados para caracterizar os microrganismos

Normas de bioseguranças em laboratório de microbiologia.

Objetivo
Conhecer a rotina de um laboratório de microbiologia.

1. Normas de Bioseguranças
Todos os laboratórios que trabalham com organismos vivos, sejam eles patogênicos ou não, seguem normas que devem ser cumpridas. São estas:
✔ Educação entre os membros;
✔ Não fumar no laboratório;
✔ Limpar bancadas e material de trabalho antes e ao término das análises;
✔ Jogar lixo nos depósitos apropriados;
✔ Não jogar resíduos sólidos na pia, descontaminar meio de cultura, resíduos líquidos devem ser jogados próximo ao ralo da pia com torneira ligada;
✔ Não entrar no laboratório sem autorização;
✔ Não manusear os equipamentos sem o devido treinamento;
✔ Usar jaleco leve, sapatos fechados, unhas não pintadas, não usar bijuteria, cabelos longos devem ser amarrados, etc.;
✔ Não fazer refeições no laboratório;
✔ Usar luvas e óculos, caso necessário;
✔ Manipular organismos patogênicos na câmara de fluxo laminar;
✔ Usar sempre pipeta, e não a boca;
✔ Descontaminar as vidrarias na autoclave;
✔ Após a descontaminação, deixar de molho as vidrarias em solução de hipoclorito de sódio + detergente;
✔ Lavar as mãos com álcool antes e depois de manusear materiais no laboratório;
✔ Qualquer acidente deve ser informado ao técnico;
✔ Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso.

1.1 Meios de Cultura
Os meios de cultura, também chamados meios de cultivo, são complexos que se destinam ao cultivo artificial de microrganismos. As técnicas de semeadura permitem que o cultivo destes microrganismos nos meios de cultura seja eficiente e que as seguintes finalidades sejam atingidas:

- crescimento bacteriano;

- isolamento bacteriano;

- estudo da morfologia colonial;

- pesquisa de patogenicidade;

- pesquisa das características bioquímicas.

Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelas bactérias para o seu crescimento e multiplicação. Para que possam fazer a síntese de sua própria matéria nutritiva devem dispor de fontes de carbono (proteínas, açúcares), fontes de nitrogênio (peptonas) e fontes de energia. São também necessários alguns sais inorgânicos, vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento.
As culturas de microrganismos devem ser guardadas em ambiente adequado, geladeira, para evitar proliferação excessiva.

1.2 Reagentes
Caso não se conheça a composição do reagente, não se deve cheirar, pois ao ser inalado pode causar danos a saúde. O mesmo deve-se evitar com os meios de culturas inoculados.


1.3 Lâminas e Lamínulas
Estas devem ser descartadas em recipiente com solução desinfetante.

Princípios e Postulados II

Parasita: é o indivíduo que vive às expensas do outro ser vivo.
Parasitismo: associação interespecífica que se processa com benefícios para uma das partes (o parasita), em detrimento da outra (o hospedeiro).
Parasitas obrigatórios ou holoparasitas: são os seres que vivem, exclusivamente, às expensas do outro ser vivo.
Parasitas facultativos: são os que levam vida mista, ora como parasita, ora como saprófita.

Endoparasitas: são os que se desenvolvem no interior do hospedeiro.
Ectoparasitas: são os que se estabelecem à superfície do hospedeiro.
Parasitas específicos: exercem o parasitismo sobre uma única espécie de planta.
Parasitas polífagos: exercem o parasitismo em mais de uma espécie de planta.

Parasitas isóicos: necessitam de apenas uma planta hospedeira para desenvolver todo o seu ciclo evolutivo.
Parasitas heteróicos: necessitam passar por dois hospedeiros distintos, a fim de completar seu ciclo.
Saprófitas:são os seres que vivem de matéria orgânica em decomposição.

nInóculo (Do lat. inoculum à in + oculum, gema): estrutura do patógeno capaz de causar infecção.
Fonte de inóculo: local onde o inóculo é produzido, ou o local onde ele se encontra antes da infecção.
Inóculo primário: é o inóculo responsável pelo início do ciclo primário das relações patógeno hospedeiro.
Inóculo secundário: é o inóculo responsável pelos ciclos secundários da doença, ou seja, é o inóculo produzido sobre o hospedeiro durante o ciclo da cultura

Princípio e Postulados -Parte I

Conceitos Básicos

Fitopatologia: estudo das fitomoléstias, em sua causa, caracterização, evolução e controle.

Doença de planta: Patógeno - Hospedeiro- Ambiente
Patógeno: o agente causal da doença.

Agente causal: Agente biótico ou abiótico que pode causar irritação e provocar uma doença.
Hospedeiro: planta que recebe o patógeno.

Sintomas e sinais

Sintomas: exteriorização da doença
Sinais: o próprio patógeno ou uma de suas estruturas

Injúria: sintomas visíveis e/ou mensuráveis ocasionados por um agente biótico ou abiótico.
Dano: redução qualitativa ou quantitativa da produção, que pode ou não causar perdas.
Perdas: efeitos negativos no rendimento econômico da cultura devido ao dano causado pelo patógeno.
Diagnose: reconhecimento e identificação de uma doença de planta, mediante a interpretação dos sintomas e dos sinais.
Diagnóstico: é o resultado da diagnose.


Etiologia: estuda as causas das doenças de plantas e tem como objetivo o estabelecimento de medidas corretas de controle.
Patogenicidade: capacidade do patógeno de associar-se ao hospedeiro, causando doença.
Virulência é a medida da patogenicidade.